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上期給大家匯總了一些有關蛋白質測序原理的基礎知識，這期著重給大家列舉一些蛋白質測序實驗中新手可能想問的問題，希望對網(wǎng)接觸蛋白質測序的實驗新手在選擇蛋白質測序方法上有指導性幫助。

1-. 蛋白質樣品純度較高，有什么快速的蛋白質測序的方法嗎？

可以通過鑒定蛋白質的肽譜圖（Peptide mass fingerprinting，PMF）達到快速測定蛋白質測序的目的。因為每個蛋白質的序列是特異的，經(jīng)過特定酶切產(chǎn)生的多肽的質量也是一定的，可以利用這一特性，通過測定蛋白質酶切后產(chǎn)生的多肽的質量圖譜，即測定蛋白質肽譜圖，再與數(shù)據(jù)庫蛋白質酶切的理論肽譜圖進行比對，從而推斷出蛋白質的序列。

2. 蛋白質肽譜圖鑒定是基于哪項質譜技術？

測定肽混合物質量數(shù)有效的質譜儀是MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜，英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry），靈敏度高，譜峰簡單，每個譜峰代表一種肽段。MALDI-TOF-MS分析肽混合物時，能耐受適量的緩沖劑、鹽，各個肽片幾乎都只產(chǎn)生單電荷離子，MALDI-TOF成為進行分析PMF的s_h_ǒ_u|選方法。

3. 肽譜圖鑒定的優(yōu)缺點？

通過測定蛋白質肽譜圖分析蛋白質序列的方法的優(yōu)勢在于此項技術只用經(jīng)過以及質譜分析來對蛋白質進行分析，測定的速度較快，因為蛋白質序列的特異性，肽譜圖法可以推斷出可信度較高的蛋白質，也較為精準。由于肽譜圖測定需要依賴數(shù)據(jù)庫信息比對，對于數(shù)據(jù)庫不包含的蛋白質，肽譜圖不能夠進行準確分析。

4. 準確度高的蛋白質測序法有哪些？

理論上蛋白質酶切產(chǎn)生的肽段圖譜是特定的，影響蛋白質酶切，以及鑒定肽段質量的因素眾多，肽譜圖對蛋白質測序來說還是一種比較粗略的測定方法，更為精準的蛋白質測定方法包括Edman降解測序法，串聯(lián)質譜測序法等。

5. 如果蛋白樣品中含有多個蛋白質，有什么方法可以一次性對所有蛋白質進行測序的嗎？

MS/MS質譜鑒定可以檢測一個蛋白條帶中的多個蛋白質，只需要將蛋白膠切下來送測序即可，在這個過程中保證切膠使用的刀具是干凈無污染的，避免切下旁邊的雜蛋白。質譜鑒定公司會對膠樣中的蛋白質進行酶切，再測定肽段序列，將肽段序列與已知蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，即可獲知膠樣中蛋白質的ID，并推測出蛋白的序列。

6. Edman降解法能夠對所有蛋白質進行測序？

Edman降解測序法的優(yōu)勢是能夠對未知的蛋白質進行測序，目前這項技術已經(jīng)近乎完善，Edman也有一定的局限性。例如，Edman講解法測序不能夠解決蛋白質N端環(huán)化、封閉的測序問題，被修飾的蛋白質不能給出確切的信號，這些都在一定程度上限制了Edman降解法的廣泛應用。

7. 對未知的蛋白質來說，如果蛋白質的N端有環(huán)化封閉現(xiàn)象，或者N端有未知修飾時，如何對蛋白質序列進行準確分析呢？

對于序列未知的蛋白質，特別是經(jīng)過改造后的重組蛋白質，體外合成蛋白質，以及改造的抗體，或者基因序列未被研究過的蛋白質，這類蛋白質的信息往往不包含在蛋白質數(shù)據(jù)庫中。要實現(xiàn)對這類蛋白質序列的準確分析就必須通過蛋白質從頭測序的方法。蛋白質從頭測序法是一項基于質譜技術的分析方法。與傳統(tǒng)質譜鑒定的方法類似，從頭測序法也是先將蛋白質酶切成小的多肽片段，接著經(jīng)由高效液相色譜對多肽片段進行分離，再依次通過兩級質譜對多肽片段序列進行測定。相較于傳統(tǒng)質譜測序，從頭測序經(jīng)過精密的算法，保證鑒定的多肽序列，能夠高準確度推導的蛋白質序列，并且能夠不依賴于數(shù)據(jù)庫比對，實現(xiàn)蛋白質序列從頭測定。

8. 如何對蛋白質測序結果進行驗證？

如果一個蛋白質的序列被成功鑒定了，那么Western blot是很好的驗證方法。由于Western blot方法的特異性和靈敏度，通過Western blot驗證的蛋白質幾乎可以1_0_0_%確定蛋白質鑒定的準確性，排出質譜鑒定的假陽性。可以選取針對蛋白質上面某一段序列制備的單克隆抗體進行檢測，再將Western blot的結果與鑒定的蛋白序預計分子量進行比對，即可確定蛋白質測序結果的準確性。

9. 已知蛋白質序列，如何對蛋白質結構進行預測？

蛋白質結構預測，即從蛋白質一級結構預測它的折疊和二級，三級和四級的蛋白質結構。目前有兩種常用的蛋白質結構預測的方法：1. 同源建模法，通過已知同源或同一家族中蛋白質的結構，再對目標蛋白質結構進行推測；2. 折疊識別法，通過已知的蛋白質折疊法作為目標蛋白質折疊的模板，再根據(jù)數(shù)據(jù)庫推測出匹配的目的蛋白質折疊的過程。

講了這么多實驗新手可能會關心的有關蛋白質測序的問題，大家實際遇到的問題各有不同，我們在這里就挑選一下具體問題進行回答

1-. Edman降解測序是否可以測定含有大概130多個氨基酸的未知蛋白？

130個氨基酸序列比較長，已經(jīng)超出了蛋白質Edman測序的限度，建議使用蛋白從頭測序（de novo se）對蛋白質序列進行測定。蛋白質從頭測序不需要借助任何蛋白質數(shù)據(jù)庫，可以對任何蛋白質，包括突變、經(jīng)過生物改造的非天然蛋白質等進行測序。

2. 實驗中通過Western blot鑒定出一種目的蛋白，分子量約29KD，想直接跑單向SDS-PAGE,切膠進行PMF，是否可行？PMF和Edman降解法那種更好？

使用SDS-PAGE分離，再將蛋白膠切下來做PMF是完全可行的。PMF比對的是肽譜圖，存在一定的假陽性概率，對蛋白純度的要求較高。建議SDS膠跑開一些，保證切下來的蛋白膠不被其他蛋白膠影響，切膠的時候注意不能被角蛋白等雜蛋白污染。PMF鑒定效率都比N端測序要更高，價格也更低。蛋白量、蛋白純度足夠高的話，PMF的結果也是同樣可信的。

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